建議抗體濃度調(diào)整到1~2mg/mL。

使用本試劑盒標(biāo)記的抗體溶液，pH在6.5~8.5為宜，最好為PBS緩沖液。緩沖液中不應(yīng)當(dāng)含有BSA等蛋白，也不應(yīng)當(dāng)含有甘氨酸或Tris等含有游離氨基的鹽類，否則可能會(huì)影響標(biāo)記效果。

取出SAlexa Fluor染料離心數(shù)秒，將管中干粉甩至管底。注：未離心前請(qǐng)勿開(kāi)蓋，以免造成損失。

SAlexa Fluor管中加入40mL DMSO用漩渦混勻儀混勻10~20s，至SAlexa Fluor全部溶解，瞬離5~10s，使溶解后的SAlexa Fluor溶液離心至管底。

抗體中加入1/10體積的調(diào)整緩沖液。

將溶解后的SAlexa Fluor加入抗體中(每0.1mg抗體中加入2mLSAlexa Fluor)，用移液槍反復(fù)吹打混勻或用漩渦混勻儀混勻10~20s。

將抗體與SAlexa Fluor混合物置水平搖床或旋轉(zhuǎn)混勻儀，在搖動(dòng)狀態(tài)下室溫避光反應(yīng)1~2小時(shí)。

將純化柱下方堵頭掰斷，1000×g離心1 min倒掉保護(hù)液，將純化柱移至新的收集管中。

將0.2 mL PBS加入管中，待全部滲入填料后，1000×g離心1min，重復(fù)2次。

將標(biāo)記反應(yīng)液加入到純化柱填料表面。如果樣品體積小于50mL，用試劑盒中的PBS補(bǔ)齊至50mL。上樣體積最大不要超過(guò)200mL。

待樣品滲入填料后，1000×g離心2min，收集純化的蛋白溶液。

將抗體標(biāo)記物4℃避光保存待用。

用PBS稀釋少量標(biāo)記蛋白。

使用路徑長(zhǎng)度為1cm的比色皿，在280nm處測(cè)量吸光度和特定染料的Amax（見(jiàn)附表）

計(jì)算蛋白質(zhì)濃度

C(mg/mL)={[A280-(Amax× Cf)]/1.4}×稀釋因子。

√C是染料-蛋白共軛物濃度；

√A280和Amax分別是在280nm處的吸光值以及在Amax波長(zhǎng)處的吸光值；

√Cf是染料校正因子見(jiàn)附表；

√稀釋因子是在光度測(cè)量時(shí)的稀釋倍數(shù)

計(jì)算標(biāo)記率的方法如下

DOL=(Amax×Mwt×稀釋因子）/(ε×C)

√C是染料-蛋白共軛物濃度；

√Mwt是IgG的分子量；

√ε是染料的摩爾吸光系數(shù)見(jiàn)附表。