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更新時間：2015-03-17
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CA1080 支原體檢測試劑盒 solarbio
貨號：CA1080
保存：4℃保存，有效期為2年，Hoechst 工作液需要避光保存。
產品內容：
Hoechst 33258 工作液 100mL 200mL
固定液 100mL 200mL
抗熒光衰減封片液 20mL 40mL
說明書 1 份 1 份
產品簡介：
本試劑盒是利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）檢測支原體污染，這種染料會結合到DNA 的A-T 富集區(qū)域，因為支原體的DNA 中A-T 含量高（55%～80%），所以可將其染色而被檢測到。被支原體污染的細胞經染色后在細胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點，即為支原體的DNA 染色斑，說明有支原體污染。Hoechst 33258 的大激發(fā)波長為346nm，大發(fā)射波長為460nm；
Hoechst 33258 和雙鏈DNA 結合后，大激發(fā)波長為352nm，大發(fā)射波長為461nm。
操作步驟：
貼壁細胞：
1. 被檢細胞接種于無菌的6 孔細胞培養(yǎng)板中，接種密度為1-2×104。同時，接種正常無支原體感染的同種細胞，作為陰性對照。
2. 5 天后，先吸去培養(yǎng)液，再加入1mL 的固定液，靜置20min，
3. 吸去固定液，晾干。
4. 于每孔中，加入1mL 的Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液須覆蓋全部被檢細胞），
37℃避光放置15-20min 或室溫靜置20～30min。
5. 吸去Hoechst 33258 工作液，加入2mL 滅菌超純水洗滌三次，直接風干。風干后加入一滴封片
液，并以蓋玻片覆蓋。
6. 熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細胞周圍是否有藍色熒光小點或串珠狀熒光小點。
懸浮細胞：
1. 收集需檢測的細胞，1500rpm，5min。
2. 將收集的細胞涂片于載玻片上，再加1mL 的固定液，靜置20min。
3. 吸去固定液，晾干。
4. 于每孔中，加入1mL 的Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液須覆蓋全部被檢細胞），
37℃避光放置15～20min 或室溫靜置20～30min。
5. 吸去Hoechst 33258 工作液，用無菌水洗滌玻片3 次，直接風干。風干后加入一滴封固液，并以
蓋玻片覆蓋。
6. 熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細胞周圍是否有藍色熒光小點或串珠狀熒光小點。
結果判斷（參考）：
陰性：僅見細胞的細胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光。
陽性：除細胞外，細胞周圍可見大量的大小均一的熒光著色顆粒。
注意事項：
1. Hoechst 工作液對人體有害，請注意防護。
2. 固定液有刺激性氣味，建議在通風櫥進行固定。
3. 支原體檢測時，好用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)2～3 代，這樣容易避免假陰性結果。
4. 本試劑盒用于6 孔板檢測時，可以進行50 次檢測反應。
5. 檢測支原體污染，可以使用支原體Vero 細胞，這樣可以提高檢測靈敏度，即將被檢測樣品
接種于Vero 細胞進行檢測。
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